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Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 783 (2023) Citar este artículo
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La cristalización de hematina es un elemento esencial de la desintoxicación hemo de los parásitos de la malaria y su inhibición por medicamentos antipalúdicos es una vía de tratamiento común. Demostramos en condiciones biomiméticas in vitro una inhibición irreversible del crecimiento de cristales de hematina debido a distintos mecanismos cooperativos que se activan ante fuerzas impulsoras de alta cristalización. La evolución de la forma de los cristales después de una exposición de tiempo limitado tanto a los metabolitos de la artemisinina como a los antipalúdicos de clase quinolina indica que el crecimiento de los cristales permanece suprimido después de que los metabolitos de la artemisinina y los medicamentos se eliminan de la solución. El tratamiento de los parásitos de la malaria con los mismos agentes revela que los pulsos inhibidores de tres y seis horas inhiben el crecimiento del parásito con una eficacia comparable a la de la exposición al inhibidor durante toda la vida del parásito. La microscopía de fuerza atómica (AFM) in situ resuelta en el tiempo, complementada con dispersión de luz, revela dos mecanismos de acción inhibidora a nivel molecular que previenen la recuperación del crecimiento de β-hematina. Los aductos de hematina de las artemisininas incitan una abundante nucleación de nanocristales no extensibles, que se incorporan a cristales en crecimiento más grandes, mientras que la pironaridina, un fármaco del tipo de las quinolinas, promueve haces escalonados, que evolucionan para engendrar abundantes dislocaciones. Se sabe que tanto los cristales incorporados como las dislocaciones inducen tensión en la red, que persiste e impide permanentemente el crecimiento de los cristales. La nucleación, la agrupación por pasos y otros comportamientos cooperativos se pueden amplificar o restringir como medio para controlar los tamaños de los cristales, las distribuciones de tamaños, las relaciones de aspecto y otras propiedades esenciales para numerosos campos que dependen de materiales cristalinos.
La hematina es el producto de la oxidación del hemo liberado en la vacuola digestiva de los parásitos de la malaria a medida que metabolizan la hemoglobina1. Para defenderse de la toxicidad de la hematina, los parásitos la secuestran en la inocua hemozoína cristalina2. Varios compuestos antipalúdicos, como los antipalúdicos del tipo quinolina3,4 y los aductos de hematina de los fármacos del tipo artemisinina, producidos por el metabolismo del parásito5,6, matan a los parásitos al inhibir la cristalización de hematina, lo que aumenta la concentración de hematina libre tóxica. Para modelar cómo los medicamentos con tiempos de residencia limitados eliminan los parásitos P. falciparum, investigamos si los antipalúdicos pueden adoptar vías que conduzcan a la inhibición del crecimiento de cristales de hematina que dura después de que se ha eliminado un inhibidor del sistema. Probamos si la inhibición irreversible de la cristalización de hematina se correlaciona con la supresión efectiva de los parásitos de la malaria mediante pulsos de tiempo limitado de cinco compuestos antipalúdicos.
Exploramos la reversibilidad de la inhibición del crecimiento de cristales de β-hematina (Fig. 1a), un análogo sintético de la hemozoína1. Para promover la relevancia fisiológica de los resultados obtenidos, utilizamos como disolvente octanol saturado con tampón cítrico, un análogo de la subfase lipídica en la vacuola digestiva del parásito7,8,9,10. Probamos la actividad de tres antipalúdicos de clase quinolina, pironaridina (PY), cloroquina (CQ) y mefloquina (MQ), y los aductos de hematina de dos fármacos de clase artemisinina11,12, artemisinina (H-ART) y artesunato (H -ARS)5. Las quinolinas inhiben la cristalización de hematina tanto in vivo como in vitro13,14,15. Los aductos de hematina de los fármacos del tipo artemisinina se forman como producto del metabolismo de la hemoglobina en la vacuola digestiva del parásito6,16,17 y también suprimen la cristalización de hematina5.
a Una imagen y un esquema de microscopía electrónica de barrido (SEM) que ilustran el hábito del cristal de β-hematina y las definiciones de longitud del cristal \(l\) y ancho \(w\). En la estructura cristalina de hematina, las esferas grises representan C, azul, N, plateado, H y rojo, O. b Imágenes SEM de cristales de β-hematina cultivados en momentos y composiciones indicadas con (i) – (iii) en (d) en presencia de 10 μM de PY. c Esquema de preservación de la forma del cristal durante el crecimiento en soluciones puras y supresión inducida por inhibidor de \(l\) o \(w\) mediante la interacción de un inhibidor con las caras axiales y laterales del cristal, respectivamente. Los contornos concéntricos denotan la forma del cristal en tiempos crecientes de crecimiento. d Esquema de la variación de la concentración del inhibidor utilizado para probar la reversibilidad de la inhibición de \(l\) y \(w\). La línea azul sólida indica cristales expuestos a una concentración de inhibidor X μM (donde X = 10 para H-ART, H-ARS y PY; 2 para CQ; y 5 para MQ) durante 3 días, después de lo cual los cristales se expusieron a una Solución libre de metabolitos o fármacos durante 10 días. La línea discontinua naranja representa cristales que se mantuvieron a una concentración de inhibidor constante X μM durante 13 días. La línea de puntos de color púrpura indica cristales expuestos a una concentración de inhibidor X μM durante 3 días; la línea gris discontinua indica controles que crecieron en una solución libre de metabolitos o fármacos durante 13 días. Los números (i) a (iii) indican composiciones y tiempos de recolección de cristales cultivados en presencia de PY y fotografiados en el panel (b). e Longitudes y anchos de cristales cultivados en soluciones de hematina 0,5 mM y en presencia de H-ART, H-ARS y PY 10 μM, 2 μM de CQ y 5 μM de MQ en la solución inicial. Las barras de error representan las desviaciones estándar de los promedios durante ca. 30 cristales para cada régimen de composición y tiempo de crecimiento. Los corchetes verticales verdes y rojos definen la longitud o el ancho acumulado durante el crecimiento entre los días 3 y 13. Los corchetes horizontales verdes y rojos vinculan los incrementos de largo y ancho que se comparan, respectivamente, en el criterio de reversibilidad 1, para H-ARS, y en el criterio 2, para PY.
El detalle mecanicista que presentamos ilumina numerosas observaciones de inhibición irreversible de la cristalización en la naturaleza, donde evolucionan arquitecturas cristalinas intrincadas guiadas por componentes minoritarios de la solución18,19. Además, los cristales industriales son guiados a morfologías preferidas mediante modificadores específicos20,21,22,23. Las actividades de los modificadores se atribuyen comúnmente a su adsorción en sitios específicos de la superficie del cristal23,24,25,26 y la reversibilidad de la adsorción predice inevitablemente que el crecimiento se recupera completamente después de que se elimina el inhibidor26,27. Múltiples casos de cristales permanentemente envenenados28 y tamaños de cristales terminales29,30 contradicen esta predicción, se destacan fuera del ámbito de los mecanismos de inhibición clásicos y hasta ahora han permanecido esquivos.
Los cristales de β-hematina suelen mostrar las caras {100}, {010} y {011} (Fig.1a). Las caras {100} son las más grandes31 y comúnmente se ubican paralelas a un sustrato7. Con esta orientación, la evolución de la longitud del cristal, monitoreada por microscopía electrónica de barrido (SEM, Fig. 1b), revela el crecimiento de las caras {011}, mientras que el ancho del cristal informa qué tan rápido crecen las caras {010} (Fig. 1a,c). En particular, las distintas estructuras de las caras del cristal anisotrópico seleccionan distintos modos de unión del inhibidor (a los pliegues o en las terrazas) y mecanismos y grados de inhibición en cada tipo de cara. Por lo tanto, no esperamos que un metabolito o fármaco inhiba todas las caras de manera uniforme, ya sea de manera reversible o irreversible. Para evaluar si la inhibición de las caras {011} y {010} durante la cristalización en masa es reversible, expusimos cristales de β-hematina a un inhibidor durante 3 días y posteriormente los transferimos a soluciones de hematina sin fármacos durante 10 días adicionales (sólido). línea azul en la Fig. 1d). La concentración de hematina de las soluciones recién preparadas fue de 0,5 mM, dentro del rango de 0,2 a 0,6 mM que se encuentra en los parásitos no tratados6. Comparamos las ganancias de longitudes y anchos de estos cristales durante los 10 días adicionales de crecimiento libre de metabolitos o fármacos con las ganancias equivalentes de los cristales que estuvieron expuestos durante ambos períodos de crecimiento a cualquiera de las soluciones puras (línea gris de trazos cortos en la Fig. 1d) o las mismas concentraciones de metabolito o fármaco (línea naranja discontinua en la Fig. 1d). Los cristales de ambos grupos de referencia se transfirieron a soluciones nuevas después de los tres días iniciales de crecimiento. La inhibición irreversible se manifestaría como aumentos significativamente más cortos de longitud y ancho durante 10 días de crecimiento libre de metabolitos o fármacos de cristales que estuvieron expuestos a un inhibidor durante los tres días iniciales en comparación con aquellos cristales que nunca estuvieron expuestos a un inhibidor (Criterio 1). y comparables a los de los cristales que crecieron en presencia de un inhibidor durante los 13 días completos (Criterio 2). Ambos criterios se basan en incrementos de longitud y ancho durante el crecimiento en soluciones recién agregadas, lo que minimiza los sesgos debidos a una posible nucleación retrasada o mejorada impulsada por fármacos y distintos tamaños de cristales que pueden imponer evoluciones de sobresaturación desiguales en las ejecuciones de prueba y referencia.
Las longitudes y anchos de los cristales de β-hematina medidos a partir de micrografías SEM (Fig. 1e y Fig. 1 complementaria) indican que H-ART parece no afectar ni a las caras {010} ni a {011}. H-ARS y los fármacos de clase quinolina suprimieron tanto la longitud como el ancho de los cristales, pero no detuvieron completamente el crecimiento, de manera consistente con sus actividades de inhibición conocidas15,26. H-ARS inhibe el crecimiento de las caras {011} y {010} de forma irreversible. La longitud aumenta durante los últimos 10 días de los cristales cultivados a partir de soluciones puras después de la exposición a H-ARS, ca. 4 ± 1 μm en promedio, son más cortos que los ca. 8 ± 2 μm controlan el crecimiento exclusivamente en soluciones puras (Criterio 1, Fig. 1e) y comparables a los incrementos de longitud de los cristales que crecieron en una solución rica en H-ARS durante todo el período de 13 días (Criterio 2, Fig. 2e). ). De manera similar, los anchos acumulados durante 10 días de crecimiento en una solución pura después de tres días de crecimiento en presencia de H-ARS son más cortos que los incrementos de ancho equivalentes de los cristales que crecieron exclusivamente en una solución pura (Criterio 1) y en presencia de H-ARS durante 13 días (Criterio 2). Los parámetros resultantes del análisis de varianza (ANOVA) de las distribuciones de las longitudes y anchos de los cristales (Tabla complementaria 1) respaldan las conclusiones de inhibición reversible de las caras {011} y {010} por H-ART e inhibición irreversible por H- ARS de ambas caras {011} y {010}. De manera análoga, ambos criterios indican una inhibición irreversible de la longitud y el ancho del cristal por PY y del ancho del cristal por CQ (Fig. 1e y Tabla complementaria 1). La inhibición irreversible de la longitud del cristal por CQ y MQ y del ancho del cristal por MQ está implícita solo en el Criterio 1 (Fig. 1e y Tabla complementaria 1), lo que sugiere un menor grado de irreversibilidad de la inhibición de las respectivas caras del cristal por parte de estos dos fármacos.
a La estructura de H-ART. b, Esquema de la inhibición de pasos por bloqueadores de torceduras, que se asocian con las torceduras y obstruyen el acceso de las moléculas de soluto. Imágenes c – e AFM de (100) superficies de cristales de β-hematina con una concentración de hematina \({C}_{H}\) = 0,50 mM. Las puntas de flecha doradas indican nanocristales en superficies de β-hematina. c Imagen fija con H-ART añadido a 10 μM. d, e Las evoluciones de nanocristales en ausencia de H-ART, en (d), y en su presencia en (e). f – h Caracterización de la dispersión de la luz de la evolución de la agregación en soluciones de hematina. f, g Las evoluciones de las funciones de autocorrelación \(G(\tau )\) de la luz dispersada durante 40 min en soluciones con \({C}_{H}\) = 0,5 mM, en (f), y con se añadió H-ART 10 μM, en (g). Las desviaciones de cero manifiestan la formación de agregados. h Las evoluciones de las amplitudes de los hombros de los agregados de \(G(\tau )\) en (f) y (g), promediadas en 10 mediciones; las barras de error indican las desviaciones estándar y son más pequeñas que los tamaños de los símbolos. i Las correlaciones de la velocidad del paso \(v\), la tasa de nucleación de la nueva capa \({J}_{{{{{\rm{2D}}}}}}\) y la tasa de crecimiento del cristal \(V\). ) con \({C}_{H}\). Diamantes de oro, soluciones libres de metabolitos; esferas de color naranja, en presencia de 10 μM H-ART. Las barras de error indican las desviaciones estándar de los promedios de ca. 30 medidas. j Imágenes secuenciales AFM de patrones de pasos en la superficie del cristal de (100) β-hematina en las concentraciones de hematina y H-ART indicadas en el panel. La punta de flecha dorada indica un nanocristal. k La velocidad del paso \(v\) en diferentes combinaciones de concentraciones de hematina y H-ART, correspondiente a las morfologías en (j).
Las observaciones SEM de inhibición irreversible contrastan marcadamente con la comprensión actual de los mecanismos moleculares de la inhibición de la cristalización y cómo los agentes antipalúdicos afectan el crecimiento de los cristales de hematina. Trabajos recientes establecieron que los cristales de β-hematina crecen por nucleación de nuevas capas, que se propagan mediante la incorporación de moléculas de soluto en pasos7,32,33. El monitoreo por microscopía de fuerza atómica (AFM) de la nucleación y el crecimiento de los pasos en las superficies de los cristales de β-hematina a la concentración más baja de hematina de 0,28 mM (en el extremo inferior del rango fisiológico6) reveló que los compuestos antipalúdicos seleccionados para este estudio emplean uno de dos mecanismos clásicos para inhibir la cristalización de β-hematina5,15,26. H-ART, H-ARS y MQ se adsorben en las torceduras y bloquean parcialmente estos sitios únicos donde las moléculas de hematina se incorporan a los pasos7. PY y CQ siguen un modo de inhibición alternativo, fijación por pasos, mediante el cual las moléculas inhibidoras se adsorben en terrazas planas y detienen el crecimiento escalonado en amplias áreas de la superficie del cristal24,27. La reversibilidad de la adsorción asumida en los mecanismos clásicos26,27 dicta que si se elimina un inhibidor de la solución, se desorbe de los respectivos sitios de la superficie y el crecimiento escalonado continúa sin inhibiciones27. Se ha documentado la reversibilidad de la inhibición del crecimiento de β-hematina a una concentración de hematina de 0,28 mM5,7,15,26. La recuperación del crecimiento escalonado puede retrasarse después de la eliminación de los inhibidores que se adsorben fuertemente; el crecimiento se reanuda a su ritmo anterior a la exposición al inhibidor cuando los inhibidores están enterrados en la red cristalina27. Si la concentración de la solución de un inhibidor es comparable a la del soluto, la incorporación excesiva de inhibidor puede tensar la red cristalina e impedir el crecimiento de los cristales durante tiempos más prolongados28,29,30. Este último mecanismo, sin embargo, no se aplicaría a la inhibición irreversible observada del crecimiento de β-hematina por H-ARS, PY, CQ y MQ, cuyas concentraciones, 10 μM e inferiores, son al menos 50 veces más bajas que las de hematina. , 0,5 mM, en el extremo superior del rango fisiológico.
AFM exploramos si la inhibición irreversible de la cristalización de β-hematina puede deberse a comportamientos únicos desencadenados por los inhibidores en concentraciones de hematina elevadas a 0,5 mM. Examinamos cómo las superficies de los cristales de hematina y la solución a partir de la cual crecen los cristales de hematina responden a la introducción y eliminación de los cinco antimaláricos en alta sobresaturación. A concentraciones moderadas de hematina de 0,28 mM o menos, H-ART (Fig. 2a) actúa exclusivamente como un bloqueador de torceduras (Fig. 2b)5. Sin embargo, en soluciones de hematina de 0,50 mM más concentradas, las observaciones de AFM in situ resueltas en el tiempo revelan que la introducción de H-ART 10 μM, comparable a las concentraciones de aductos de hemo encontradas en trofozoítos expuestos a artemisininas16, provoca la deposición de numerosos nanocristales de hematina (identificados a partir de su hábito característico, Fig. 1a) en la superficie de (100) β-hematina (Fig. 2c). A diferencia de los nanocristales que aparecen esporádicamente en soluciones sin inhibidores en concentraciones similares (Fig. 2d), los nanocristales observados en presencia de H-ART no crecen (Fig. 2e). De manera consistente con los numerosos nanocristales observados por AFM, el monitoreo de la dispersión de la luz de las soluciones de hematina 0,5 mM revela una población creciente de cristales y una aceleración sustancial de la nucleación de los cristales en presencia de H-ART 10 μM (Fig. 2f – h). Tanto en soluciones libres de metabolitos como en soluciones ricas en H-ART, el monitoreo AFM revela tendencias decrecientes de la velocidad del paso \(v\), la tasa de nucleación de la nueva capa \({J}_{2D}\) y la tasa de crecimiento normal de la cara. \(V\) a medida que aumenta la concentración de hematina (Fig. 2i), una aparente violación de la ley de acción de masas. En soluciones libres de metabolitos o fármacos, los segmentos decrecientes de las correlaciones \(v\), \({J}_{{{{{\rm{2D}}}}}}\) y \(V\) con \({c}_{H}\) se han atribuido a la contracción de las terrazas (Fig. 2b), que sirven como conductos esenciales para la transferencia de moléculas de hematina desde la solución a los escalones33. En presencia de H-ART, las tendencias decrecientes comienzan con una concentración de hematina mucho más baja, donde las terrazas son amplias (Fig. 2c, e). Correlacionamos este comportamiento fuertemente contrario a la intuición con la nucleación creciente de nanocristales que se depositan en la superficie y, a medida que el cristal crece, quedan enterrados en el cristal en orientaciones aleatorias (Fig. 2c, e, j).
La disminución de las tasas de cristalización revela que los cristales enterrados reducen la fuerza impulsora de la cristalización, probablemente al tensar el cristal y aumentar el potencial químico de las moléculas de hematina en la red30,34,35. Para probar si la secuencia de nucleación de nanocristales impulsada por metabolitos, deposición, enterramiento en el cristal grande y una mayor tensión de la red conducen a una inhibición irreversible, realizamos ciclos a través de dos concentraciones de hematina, 0,28 y 0,5 mM, con H-ART 0 o 10 μM. (Figura 2j, k). La eliminación de H-ART detiene la nucleación de nanocristales (Fig. 2j). Sin embargo, la tensión reticular sospechada persiste después de que se elimina el metabolito y suprime el crecimiento de β-hematina incluso en ausencia del inhibidor (Fig. 2j).
De manera similar al H-ART, el H-ARS adsorbido bloquea reversiblemente el acceso a las torceduras de los cristales de β-hematina que crecen a una concentración moderada de hematina5. Sin embargo, cuando se introduce en soluciones de hematina 0,5 mM, H-ARS provoca una respuesta casi idéntica a la de H-ART (Figura complementaria 2). H-ARS provoca una abundante nucleación de nanocristales, que se incorporan a cristales más grandes de β-hematina. La acumulación esperada de tensión reticular es la causa probable de la recuperación incompleta del crecimiento escalonado después de que H-ARS se purga de la solución.
En concentraciones moderadas de hematina, PY (Fig. 3a) inhibe el crecimiento de β-hematina fijando los pasos15. La inhibición del crecimiento por pasos se amplifica mediante la estabilización de los pares de pasos (Fig. 3b), que evolucionan hacia grupos de pasos y macropasos15. PY no impulsó la nucleación de nanocristales y AFM no mostró evidencia de que los nanocristales interfirieran con el crecimiento de cristales de β-hematina más grandes (Fig. 3c). PY exhibió un mecanismo completamente diferente de supresión irreversible del crecimiento. A concentraciones elevadas de soluto, afloraron dislocaciones de tornillos en la superficie del cristal (Fig. 3d), probablemente como consecuencia del cierre imperfecto de las inclusiones de solución generadas por los macropasos34 (Fig. 3d). Las dislocaciones tensan la red34; Además, la alta densidad de pasos que se originan en las dislocaciones de los tornillos retrasa aún más la propagación de los pasos, la generación de capas y la tasa de crecimiento de los cristales debido a las terrazas más estrechas desde las que se alimentan los pasos32,33 (Fig. 3e-g). La eliminación de PY no restablece la tasa de crecimiento de la superficie a su valor inicial, ya que se conservan las altas densidades de ambos pasos y dislocaciones (Fig. 3h, i).
a La estructura de PY. b Ilustración esquemática de la estabilización de pares de pasos por PY. c, d Imágenes AFM de (100) superficies de cristales de β-hematina en \({C}_{H}\) = 0,28 mM, en (c), y después de la adición de 4 μM PY, en (d). Las leyendas en d amplían los segmentos rodeados d1 y d2, donde los macropasos se pliegan para generar una dislocación. e–g Las correlaciones de la velocidad del paso \(v\), la densidad del paso adimensional \(p\) y la tasa de crecimiento cristalino \(V\) con \({C}_{H}\) en presencia de 2 y 4 µM PY. Las barras de error abarcan dos desviaciones estándar de los promedios de ca. 30 medidas. h Patrones de pasos en la superficie del cristal de (100) β-hematina en las concentraciones de hematina y PY indicadas en el panel. Las flechas indican puntos de afloramiento de dislocación manifestados como centros de escalones en espiral. i La velocidad del paso \(v\) en diferentes combinaciones de concentraciones de hematina y H-ART, correspondiente a las morfologías en (h).
La respuesta de la dinámica de las superficies de los cristales de β-hematina a CQ (Fig. 4a), un fijador de pasos (Fig. 4b) 15, es diferente de la de H-ART, H-ARS y PY. A diferencia de los dos aductos de artemisinina, un aumento en la concentración de hematina en presencia de CQ no conduce a una nucleación excesiva de nanocristales de β-hematina en el medio de crecimiento (Fig. 4c). Además, el aumento de la sobresaturación da como resultado una velocidad de paso más alta (Fig. 4d, etapa 3) y la eliminación de CQ de la solución de crecimiento da como resultado un aumento progresivo en la velocidad de paso de modo que se observa una recuperación completa de las tasas de crecimiento de la superficie a su estado inicial dentro de varios minutos (Fig. 4d, etapa 5). La recuperación de la velocidad del paso indica que la acción de CQ en la cara (100) de la β-hematina es completamente reversible, en marcado contraste con los comportamientos únicos de H-ART, H-ARS y PY. La generación de pasos y el crecimiento en la cara (100) de la β-hematina responden a una alta sobresaturación y a la presencia de MQ, un bloqueador de torceduras, de manera análoga a la respuesta a CQ (Figura complementaria 3). En particular, MQ y CQ no estimulan la nucleación de nanocristales de hematina ni la formación de grupos de pasos y macropasos.
a La estructura de CQ. b Esquema de la inhibición de escalones mediante fijadores de escalones, que se adsorben en las terrazas entre los escalones, lo que obliga a los escalones a doblarse para crecer entre los dos fijadores. Si la separación entre dos pasadores Δx es más corta que el diámetro bidimensional crítico \(2{R}_{{{{{\rm{crit}}}}}}\), el crecimiento escalonado cesa. Si Δx es más largo pero comparable a \(2{R}_{{{{{\rm{crit}}}}}}\) el crecimiento del paso se retrasa. c Patrones de pasos en la superficie del cristal de (100) β-hematina en las concentraciones de hematina y CQ indicadas en los paneles. d La velocidad del paso \(v\) en diferentes combinaciones de concentraciones de hematina y CQ, correspondiente a las morfologías en (c).
La comparación de las respuestas a los bloqueadores de kink (H-ART, H-ARS y MQ) con las de PY y CQ, dos inhibidores que se adsorben en las terrazas, revela que la reversibilidad de un modificador no está correlacionada con su mecanismo de inhibición. Más bien, la inhibición puede persistir después de que se elimina el inhibidor si desencadena respuestas cooperativas, como la nucleación/deposición de cristales o la formación de macropasos, que impactan permanentemente el cristal en crecimiento de maneras que suprimen el crecimiento.
Los mecanismos moleculares activados por H-ART, H-ARS y PY para inhibir irreversiblemente las caras {100} de la β-hematina sugieren posibles vías que los agentes antipalúdicos pueden seguir para inhibir las caras {011} y {010}. La nucleación de nanocristales promovida por H-ARS y su incorporación fuera de registro en cristales en crecimiento es la causa probable de la inhibición irreversible de las caras {011} y {010}. Por otro lado, PY, CQ y MQ no mejoran la nucleación de los cristales, por lo que estos antipalúdicos pueden inhibir irreversiblemente las caras {011} y {010} al interferir con la dinámica del paso, similar a los efectos de PY en las caras {100} caras.
Probamos si la inhibición irreversible de la cristalización de hematina se correlaciona con la supresión del crecimiento del parásito de la malaria dependiente de la dosis y el tiempo del inhibidor. En particular, incluso si un metabolito o fármaco inhibe irreversiblemente solo una de las caras del cristal de hematina (Fig. 1a), aún retrasará el secuestro de hematina y contribuirá a la acumulación de porfirina, producida continuamente por la digestión de la hemoglobina. Por lo tanto, esperamos que los cinco compuestos probados aquí muestren una supresión irreversible de los parásitos de la malaria.
Elegimos la cepa NF54 de P. falciparum, sensible a la mayoría de los antipalúdicos, y sincronizamos cuidadosamente las edades de todos los parásitos en el cultivo. Expusimos los parásitos a pulsos de 3 o 6 h de diversas concentraciones de fármacos, establecidos en múltiplos de la concentración inhibidora media máxima para una exposición continua de 72 h a un metabolito o fármaco (IC50, figura complementaria 4), después de lo cual Lavamos e incubamos los parásitos en medios libres de metabolitos o fármacos (Fig. 5a). Medimos la fracción de parásitos supervivientes utilizando hipoxantina radiactiva [3H], un biomarcador para la replicación del ADN. La hipoxantina es una nucleobase purina que se incorpora al ADN recién creado cuando un parásito comienza su replicación al final del segundo día de su ciclo de vida de eritrocitos. La señal radiactiva al final de una incubación de 72 h escala la replicación del ADN con la fracción de parásitos supervivientes36,37.
a Esquema del ensayo de pulso de fármaco con detección de [3H] hipoxantina para la supervivencia del parásito. b Fracción de parásitos que sobrevivieron durante 72 h después de que se sincronizaron sus ciclos de vida. Las concentraciones se refieren al inhibidor indicado en el panel respectivo. Los parásitos fueron expuestos durante 6 h a H-ART, H-ARS, PY, CQ y MQ, introducidos a las 0, 5, 24 y 29 h de vida. Estas edades de parásitos corresponden a parásitos jóvenes en etapa de anillo, parásitos viejos en etapa de anillo, trofozoítos jóvenes y trofozoítos viejos, respectivamente. La leyenda está en el panel MQ. Las líneas verticales finas y los números adyacentes indican valores de CI50 del inhibidor continuo medidos de forma independiente, la concentración de un fármaco que inhibe el 50% de los parásitos con una exposición al inhibidor de 72 h. Estas líneas horizontales marcan el 50% de supervivencia del parásito. Los paréntesis horizontales y los números adyacentes indican las proporciones de las concentraciones de inhibidor que suprimen el 50% de los parásitos de cada edad en un pulso de 6 h con respecto a la CI50 continua del fármaco.
Para discriminar si la actividad del inhibidor se relaciona con la supresión de la hemozoína, iniciamos los pulsos del fármaco en cuatro edades del parásito que difieren según la etapa de cristalización de la hemozoína (Fig. 5a): anillos jóvenes, en los que la hemozoína comienza a nuclearse, anillos viejos, cuando la hemozoína comienza a nuclearse. los cristales son pequeños, y los trofozoítos jóvenes y viejos, en cuyas etapas, en los parásitos no tratados, crecen los cristales de hemozoína6. Todos los compuestos, excepto PY, introducidos en anillos jóvenes y eliminados 6 h después, inhiben sustancialmente menos crecimiento del parásito que cuando se introdujeron en etapas posteriores del parásito (Fig. 5b). La actividad inhibidora más débil en la edad del parásito, cuando los cristales de hemozoína son pocos y pequeños, es consistente con la inhibición del crecimiento de hemozoína como la vía principal de acción inhibidora. Además, los cinco compuestos se protonan parcialmente al invadir la vacuola digestiva para ajustarse a su pH (aprox. 5,038) más bajo que el de la sangre y el citosol de los eritrocitos (aprox. 7,35), pero no sufren más modificaciones químicas13,17,39. Por lo tanto, la débil respuesta a los pulsos inhibidores aplicados a los anillos jóvenes sugiere que los compuestos no se retienen en etapas posteriores del parásito y probablemente migran fuera de la vacuola digestiva.
Guiados por la relación de los tiempos de exposición al inhibidor, 72 y 6 h, definimos la supresión de parásitos mediante un inhibidor como irreversible si la concentración a la que un pulso de fármaco de 6 h inhibe el crecimiento del parásito a la mitad es inferior a 12 veces su valor IC50. la concentración que inhibe el 50% del crecimiento del parásito durante 72 h de exposición continua al fármaco. La aplicación de este criterio a las fracciones de supervivencia de los trofozoítos después de pulsos de 6 h (Fig. 5b y Tabla complementaria 2) revela que los aductos H-ART y H-ARS requirieron (5–11) × IC50 para una inhibición del 50% de los trofozoítos, mientras que las quinolinas requirieron California. (2–6) × IC50 continuo. PYR logró una inhibición del pulso en la etapa de anillo del 50% a 2 × IC50 y CQ requirió 10 × IC50 para la inhibición de la etapa de anillo, mientras que MQ no inhibió los anillos. CQ y H-ART tenían un rango IC50 de fármaco en pulsos para todas las etapas en el rango de cinco a nueve veces con un cambio en la pendiente para los anillos jóvenes, H-ARS 10–11 × para todos menos los anillos jóvenes en 17 ×, MQ con etapas de trofozoíto de proporción doble sin inhibición de anillos. La capacidad de MQ para inhibir los cristales de hemozoína puede ser un mecanismo secundario a la síntesis de proteínas o a la inhibición de la purina nucleósido fosforilasa de P. falciparum40,41,42. PY tenía una relación IC50 de 2× para anillos, 5× para trofos jóvenes y 9× para trofozoítos viejos.
En general, todos los agentes probados suprimieron las poblaciones de parásitos de forma irreversible cuando se aplicaron en la etapa de trofozoíto o, en el caso de PY, también en la etapa temprana del anillo. Los pulsos de PY son más efectivos si se aplican a anillos jóvenes, lo que sugiere que PY puede retrasar la nucleación de los cristales de hemozoína, de acuerdo con las observaciones de AFM de la cristalización de β-hematina (Fig. 3c, d, h).
Tenga en cuenta que este ensayo de pulso difiere de los ensayos de pulso en etapa de anillo de artemisinina, que examinan la actividad de los fármacos de artemisinina en etapas de anillo de parásitos de la malaria genéticamente diversos. Aquí comparamos diversos compuestos en un solo aislado de P. falciparum en cuatro etapas distintas.
Los pulsos de metabolito o fármaco de 3 h aproximadamente duplicaron la CI50 y la proporción de veces, excepto PY, que fue aproximadamente la misma (Figura complementaria 5). La migración de los compuestos fuera de la vacuola digestiva, sugerida por las débiles respuestas de los parásitos en etapa de anillo, significa que la eficacia de los metabolitos o pulsos de fármacos a corto plazo no se debe a la cantidad de inhibidor residual. Por lo tanto, la potente supresión por exposiciones de 3 y 6 h a los fármacos se asocia con una supresión irreversible de la cristalización de hemozoína, lo que conduce a la acumulación de hematina por encima del límite de toxicidad del parásito.
Demostramos que los agentes antipalúdicos movilizan dos mecanismos para suprimir irreversiblemente el crecimiento de β-hematina incluso después de que el metabolito o los fármacos se eliminan de la solución de crecimiento. En ambos casos, la irreversibilidad probablemente se debe a la tensión en la red cristalina. Esta cepa surge debido a la cooperatividad de moléculas, que promueve la nucleación de nanocristales que se incorporan a cristales de β-hematina, o entre pasos de crecimiento, que se agrupan en macropasos y producen abundantes dislocaciones. Ambos modos cooperativos de acción están impulsados por altas desviaciones del equilibrio. La correspondencia recientemente identificada entre la inhibición irreversible de la cristalización y la supresión irreversible de los parásitos de la malaria sugiere que la inhibición irreversible de la cristalización de hematina puede ser esencial para la actividad antiparasitaria antipalúdica. En el contexto de la síntesis de cristales, estos hallazgos sugieren que los tamaños de los cristales, las distribuciones de tamaño, las relaciones de aspecto y otras propiedades esenciales para numerosos campos pueden controlarse amplificando o restringiendo los comportamientos cooperativos que invocan la supresión irreversible del crecimiento de los cristales y los parásitos de la malaria.
Los siguientes compuestos se adquirieron de Sigma Aldrich: hematina porcina (≥ 98%), ácido cítrico (anhidro, ≥ 99,5%), hidróxido de sodio (anhidro, ≥ 98%), n-octanol (anhidro, ≥ 99%), hematina porcina. , artemisinina (≥ 98%), artesunato (anhidro, ≥ 98,0%), difosfato de CQ (≥ 98%), clorhidrato de MQ (anhidro, ≥ 98,0%). sorbitol, tetrafosfato de PY (\(\ge \, \)95%), hipoxantina, saponina, dodecilsulfato de sodio (SDS), bicarbonato, bicarbonato de sodio (NaHCO3, hipoxantina y HEPES. El siguiente producto químico se adquirió de ThermoFisher Scientific: RPMI 1640 medios suplementados con l-glutamina y gentamicina. El suero humano se obtuvo del banco de sangre interestatal. Todos los reactivos se usaron tal como se recibieron sin purificación adicional a menos que se indique lo contrario. Todos los materiales se usaron tal como se recibieron. El agua desionizada (DI) se produjo mediante un Millipore inverso Sistema de intercambio iónico por ósmosis (Rios-8 Proguard 2–MilliQ Q-guard).
Se preparó tampón cítrico a pH 4,8 disolviendo 50 mM de ácido cítrico en agua desionizada y valorando la solución, en agitación continua, con la adición de NaOH 0,10 M para alcanzar el pH deseado, como se verificó antes de cada experimento utilizando un medidor de pH Accumet Basic ( Termofisher científico). Se prepararon tampones nuevos cada mes y se almacenaron en condiciones ambientales. Colocamos 5 ml de tampón cítrico (pH 4,8) en contacto directo con n-octanol a temperatura ambiente y dejamos 30 minutos para que se equilibrara. La porción superior del sistema de dos fases se decantó y se denominó octanol saturado con tampón cítrico (CBSO). Las soluciones de hemo se prepararon disolviendo polvo de hemo en 8 ml de CBSO recién preparado y calentándolo a 70 °C durante 7 a 9 h. La solución se filtró a través de un filtro de membrana de nailon de 0,2 μm (ThermoFisher Scientific) y la concentración se determinó utilizando un coeficiente de extinción previamente informado7 de 3,1 ± 0,1 cm-1 mM-1 medido a una longitud de onda de λ = 594 nm.
Las soluciones de hematina se prepararon mediante un método modificado utilizando el mismo procedimiento anterior pero mediante la sustitución de n-octanol por n-butanol. Ditionito de sodio a ca. 1 mM y artemisinina (ART) a ca. Se disolvió 1 mM en agua desionizada y n-butanol, respectivamente. La solución de hemo se filtró con un filtro de membrana de nailon de 0,2 µm y se puso en contacto con la solución de ditionito en un vial de vidrio para producir una relación molar neta de 1:2:5 de hemo: ART: ditionito de sodio. El vial se selló bajo un flujo de gas nitrógeno para crear una atmósfera inerte. La reacción implicó la reducción de hierro (III) a hierro (II) en hematina con ditionita actuando como agente reductor. El sistema se mantuvo a 50 °C utilizando un baño de agua (placas calefactoras de agitación digital multiposición Super-Nuova). Las fases acuosa y orgánica se mezclaron rigurosamente agitando durante aprox. 30 s hasta que el color de la solución cambió de verde oscuro a rosa, lo que indica la reducción de hematina (que contiene Fe (III)) a hemo (que contiene Fe (II)). La mezcla se mantuvo en condiciones estáticas durante al menos 30 minutos para permitir la separación de las fases orgánica y acuosa, después de lo cual se inyectó la solución de artemisinina en la fracción orgánica (superior). La reacción entre el hemo y la artemisinina ocurrió inmediatamente después de la inyección, a juzgar por el cambio instantáneo de color de rosa a naranja. Después de permitir ca. 30 minutos para que se completara la reacción, se recogió la capa orgánica para la posterior purificación del producto, aducto hemo-artemisinina (o H-ART).
El procedimiento para sintetizar el aducto hemo-artesunato (H-ARS) fue idéntico al del H-ART con la sustitución del ART por artesunato (ARS). Se utilizó el mismo procedimiento de reacción con la única diferencia notable que fue una reacción más rápida para generar H-ARS, como se desprende de un cambio de color más rápido después de la adición de ARS a la solución de hemo (II).
Se proporcionan más detalles sobre los procedimientos para purificar e identificar H-ART y H-ARS mediante espectroscopia de masas en la Ref. 5.
Se preparó una solución de crecimiento de hematina disolviendo hematina en polvo en 8 ml de CBSO recién preparado, seguido de un período de calentamiento de 7 a 9 h a 70 °C. La solución se enfrió a temperatura ambiente en condiciones ambientales y se filtró con un filtro de membrana de nailon de 0,2 µm. La concentración se determinó con un coeficiente de extinción \({\varepsilon }_{{{{{\rm{heme}}}}}}=3.1\pm 0.1\,{{{{{{\rm{cm}}} }}}}^{-1}\,{{{{{\rm{mM}}}}}}}^{-1}\,{{{{{\rm{en}}}}}} \,\lambda =594\,{{{{{\rm{nm}}}}}}\). Luego, la solución de hematina se diluyó con CBSO fresco para lograr una concentración final de 0,20 µM. Se colocó un trozo de cubreobjetos, limpiado con múltiples ciclos de agua, etanol y agua, en el fondo de un vial de vidrio y se sumergió en una solución de crecimiento de hemo. Los viales de vidrio se sellaron con tapas con septos cerrados y se almacenaron en una plataforma estacionaria en la oscuridad a temperatura ambiente. Aparecieron pequeños cristales en los portaobjetos de vidrio después de 2 a 3 días y alcanzaron un tamaño máximo (aproximadamente 20 μm) después de dos semanas. Los portaobjetos de vidrio que contenían cristales se enjuagaron con etanol y agua desionizada y se secaron al aire antes del análisis.
Los experimentos se realizaron con un nanoscopio multimodo VIII y microscopios de fuerza atómica (AFM) IV de Digital Instruments. Las imágenes de AFM se recogieron en modo de golpeteo (es decir, ligeramente activado) utilizando sondas Olympus TR800PSA (nitruro de silicio, recubierto de Cr/Au 5/30, constante de resorte de 0,15 N m-1) con una frecuencia de 32 kHz. Las imágenes se obtuvieron utilizando tamaños de escaneo de 0,3 a 20 μm, velocidades de escaneo de 0,5 a 2,5 s-1, 256 líneas de escaneo y varios ángulos de escaneo según la orientación del sustrato de cristal. La temperatura en la celda líquida alcanzó un valor estable de 27,8 ± 0,1 °C dentro de los 15 minutos posteriores a la obtención de la imagen15. Este valor era superior a la temperatura ambiente debido al calentamiento provocado por el funcionamiento del escáner AFM. La densidad de los sustratos de cristales de hemo cultivados en discos de vidrio (como se describe anteriormente) se controló con un microscopio óptico para garantizar un número equivalente de cristales para todas las muestras (es decir, minimizar el agotamiento potencial de hemo libre e inhibidor de crecimiento debido a la alta superficie total de cristales). Los portaobjetos de vidrio se montaron en discos de muestra AFM (Ted Pella) y las muestras se colocaron en el escáner AFM. Las soluciones de hemo sobresaturadas en CBSO se prepararon con menos de 2 h de antelación. La solución de crecimiento se cargó en la celda líquida AFM usando una jeringa de polipropileno desechable de 1 ml (Henck Sass Wolf), que tolera los disolventes orgánicos. Después de la carga, el sistema se dejó reposar durante 10 a 20 minutos para que se equilibrara térmicamente. Los bordes del cristal en micrografías ópticas se identificaron para determinar la orientación y las direcciones cristalográficas en la superficie del cristal orientada hacia arriba (100). Los cristales se mantuvieron en contacto con la solución durante 0,5 a 1,5 h para permitir que las características de su superficie se adaptaran a las condiciones de crecimiento.
La dirección de escaneo se configuró paralela a la dirección cristalográfica [001] y se recolectaron imágenes de AFM durante 3 a 5 h. La solución en la celda líquida de AFM se intercambió cada 30 minutos para mantener una concentración de hemo (un inhibidor) aproximadamente constante. Para los estudios de antipalúdicos, las soluciones de crecimiento se reemplazaron por otras que contenían una concentración de inhibidor seleccionada. Para cada ensayo, primero se dejó que los sustratos cristalinos se equilibraran (aproximadamente 30 minutos) en una solución de crecimiento sin inhibidor añadido antes de agregar las soluciones que contenían el inhibidor. Para los estudios que evalúan la inhibición irreversible, se suministraron a la celda líquida AFM una serie de soluciones con diferentes concentraciones de hemo y/o inhibidor en tiempos de obtención de imágenes periódicos. Para todas las mediciones in situ, el crecimiento de las superficies de los cristales de hemo a través de la generación y propagación de capas bidimensionales (2D) se caracterizó por la velocidad de avance del paso v (nm/s) y la tasa de nucleación 2D de nuevas capas de cristales J2D (nm −2 s−1) utilizando protocolos informados15. En resumen, determinamos v monitoreando los desplazamientos de 8 a 13 escalones individuales con una altura de escalón medida \(h\) = 1,17 ± 0,07 nm (correspondiente a la dimensión de la celda unitaria en la dirección a). Aproximadamente, se tomaron entre 25 y 35 mediciones para cada paso individual y las velocidades promedio de los pasos se evaluaron mediante análisis de imágenes secuenciales a lo largo del tiempo. Para determinar J2D se monitorizó la aparición de nuevas islas en la superficie entre imágenes sucesivas y se contó el número de islas que crecieron. Este número se amplió con el área de escaneo y el intervalo de tiempo entre imágenes para producir J2D (evaluado a partir de un promedio de 15 a 25 mediciones).
En la mayoría de las condiciones probadas aquí, se forman múltiples núcleos al mismo tiempo y se fusionan para cubrir la cara. Bajo estas condiciones43 la tasa de crecimiento del cristal \(V\) en dirección normal a la cara observada se evalúa como \(V\cong {\lambda }^{2}{J}_{2D}\,h\,\cong \,h{({v}^{2}{J}_{2D})}^{1/3}\) donde \({{{{{\rm{\lambda }}}}}}={ \left(v/{J}_{2D}\right)}^{1/3}\) es el espacio entre núcleos individuales33. En presencia de hematina PY, las superficies de los cristales están cubiertas por trenes de pasos paralelos. La nucleación de nuevas capas no se puede observar y \({J}_{2D}\) no se puede medir. Medimos la densidad de pasos adimensional \(p=h/l\), donde \(l\) es la separación entre pasos. La tasa normal de crecimiento \(V\) se evalúa como \(V={pv}\).
Los datos de dispersión dinámica de la luz se recopilaron mediante un instrumento ALV (ALV-GmbH, Alemania), que incluye un goniómetro ALV, un láser He-Ne con una longitud de onda de 632,8 nm y un correlador digital tau múltiple ALV-5000/EPP. Se recogieron funciones de correlación de intensidad normalizada \(G(q,\tau )\) en un ángulo de dispersión fijo de 90o durante 60 segundos. El tiempo de difusión característico \({\tau }_{c}\) para los cristalitos de hematina y la amplitud respectiva \({A}_{c}\) (que es proporcional a la intensidad dispersada por los cristalitos) se calcularon ajustando \(G(q,\tau )\) con una relación exponencial44,45 \(G\left(q,\tau \right)-1={({A}_{c}{{\exp }}\left (-\tau /{\tau }_{c}\right))}^{2}+\varepsilon (\tau )\), donde \(\varepsilon (\tau )\) es el ruido de fondo en la función de correlación .
Los cristales de hematina se cultivaron como se describió anteriormente a una concentración de 0,50 mM en presencia de un fármaco antipalúdico. Las concentraciones de inhibidor fueron una concentración de 10 μM para H-ART, H-ARS y PY; 2 µM para CQ; y 5 µM para MQ. Se insertaron tres portaobjetos de vidrio en la solución de crecimiento. Después de tres días se observaron pequeños cristales de β-hematina en los portaobjetos. Uno de los portaobjetos se transfirió a una solución recién preparada con los mismos componentes que la solución aplicada antes y otro se transfirió a un metabolito o solución libre de fármaco con la misma concentración de hematina, 0,50 mM. Estos cristales crecieron durante 10 días más. Los cristales del tercer portaobjetos se conservaron como referencia. Para el control, los cristales se cultivaron durante tres días en ausencia de aditivos y luego uno de los portaobjetos se transfirió a una solución nueva sin aditivos con la misma concentración inicial de hematina. Los portaobjetos con los cristales se extrajeron, se secaron y se tomaron imágenes con SEM. Para ello, los portaobjetos se enjuagaron con agua desionizada y se secaron con etanol puro. Los portaobjetos y el cristal adherido a ellos se recubrieron con oro de 15 nm. Se midieron y promediaron los anchos y largos de al menos 30 cristales cultivados en cada composición de solución y régimen inhibidor.
Para juzgar si la inhibición es reversible, comparamos los aumentos en longitudes y anchos de estos cristales durante los 10 días adicionales de crecimiento libre de metabolitos o fármacos con los aumentos equivalentes de los cristales que crecieron durante 13 días en soluciones puras (línea gris discontinua corta en la Fig. 1d) o en presencia de las mismas concentraciones de inhibidor (línea naranja discontinua en la Fig. 1d). La inhibición irreversible se manifestaría como aumentos de longitud y ancho del primer grupo de cristales que son más cortos que los de los cristales que nunca estuvieron expuestos a inhibidores (Criterio 1) y comparables a los de los cristales que crecieron en presencia de inhibidores durante 13 días ( Criterio 2).
Una mayor cantidad de cristales y dimensiones de cristal más grandes en una de las poblaciones en comparación con los Criterios 1 y 2 pueden potenciar un consumo de soluto más rápido y una sobresaturación más baja en tiempos de crecimiento más prolongados, lo que lleva a longitudes y anchos más cortos que no son causados por la actividad inhibidora. El Criterio 1 compara los incrementos promedio de longitud y ancho de dos poblaciones de cristales que crecieron, respectivamente, en presencia y ausencia de un inhibidor durante los tres días iniciales. La introducción de una solución nueva, en la que la concentración de hematina es igual a los 0,50 mM iniciales, minimiza el impacto en la evolución de la sobresaturación de un número potencialmente desigual de cristales debido a una nucleación más rápida o más lenta inducida por inhibidores. Los cristales que crecieron en presencia de un inhibidor durante los tres días iniciales eran, en promedio, aproximadamente equisados o más cortos y delgados que los cristales que crecieron en soluciones sin inhibidores (Fig. 1e). En consecuencia, el consumo de soluto en la segunda solución sería similar al de los viales con cristales que inicialmente crecieron en soluciones sin inhibidores o más lentamente. La sobresaturación en las últimas etapas de crecimiento sería igual o mayor que la de los viales con cristales que inicialmente crecieron en soluciones libres de inhibidores. Por lo tanto, parece poco probable que una sobresaturación más baja durante el crecimiento secundario de los cristales pueda retrasar el aumento de las dimensiones de los cristales más allá de la supresión debido a los efectos inhibidores irreversibles.
El Criterio 2 compara los aumentos en la longitud y el ancho promedio de las poblaciones de cristales que se formaron en condiciones idénticas de modo que el número de cristales y las dimensiones de los cristales sean aproximadamente iguales al comienzo del crecimiento de 10 días. Las igualdades aproximadas de números y dimensiones de cristales en estas dos poblaciones aseguran que durante el crecimiento de los cristales la sobresaturación se mantenga aproximadamente igual. Por lo tanto, las diferencias observadas en las longitudes y anchos promedio de los cristales son atribuibles a la inhibición irreversible de los antipalúdicos.
Para este estudio, obtuvimos sangre de donantes vivos que no son identificables para los investigadores. Los eritrocitos humanos se obtienen de voluntarios sanos según los protocolos aprobados por el IRB de Johns Hopkins.
Se disolvieron difosfato CQ (C-6628, Sigma Aldrich) y tetrafosfato PY (sc-205828A, Chem Cruz) en H20 estéril de calidad para cultivo celular. Los aductos de H-ART y H-ARS, sintetizados como se analizó anteriormente, y el clorhidrato de MQ (M2319, Sigma Aldrich) se disolvieron en DMSO (D128500, ThermoFisher). Para su uso en ensayos de parásitos, diluimos aún más todos los compuestos y aductos probados en medios de cultivo sin inhibidores, asegurando que los niveles de DMSO o H2O nunca alcanzaran una concentración final superior al 1 % cuando se colocaron en el cultivo de parásitos.
Los experimentos in vitro involucraron P. falciparum NF54 (MRA-1000) que se obtuvieron a través de BEI Resources. Los cultivos de parásitos se mantuvieron bajo una modificación del método de Trager y Jensen46. Específicamente, los parásitos se cultivaron con un hematocrito del 2 % en medio RPMI 1640 suplementado con l-glutamina, HEPES 25 mM, NaHCO3 al 0,25 %, hipoxantina 0,37 mM, 50 µl de gentamicina 50 mg/ml y suero humano al 10 %. Los cultivos se incubaron a 37 °C en 5%CO2/5%O2/N2 equilibrado.
Para determinar la CI50 para cada inhibidor, los cultivos de P. falciparum se sincronizaron con la etapa de anillo mediante incubación en sorbitol al 5%. La parasitemia se evaluó mediante microscopía óptica de una extensión de sangre teñida con Giemsa. El valor de CI50 se determinó utilizando una versión modificada del ensayo de incorporación de [3H]-hipoxantina37. Cada concentración de inhibidor se realizó en tres réplicas técnicas. Los pocillos de control de crecimiento negativo contenían CQ 10 µM. Los pocillos de control de crecimiento positivo contenían medios de cultivo libres de inhibidores. Los cultivos de parásitos se sembraron en placas de 96 pocillos tratadas con cultivo de tejidos (353072, Falcon) con un hematocrito del 2 % y una parasitemia del 0,5 % en un volumen final de 200 µl de medio completo sin hipoxantina. Los cultivos de parásitos se incubaron con un inhibidor de forma continua durante 72 h a 37 °C. En el momento de la incubación con inhibidor, se añadieron a cada pocillo 0,5 μCi de [3H]-hipoxantina. Una vez finalizado el período de incubación, las placas de 96 pocillos se congelaron a -80 °C hasta que estuvieron listas para la recolección de la muestra. Las placas de 96 pocillos se descongelaron y las muestras se recogieron en filtros de fibra de vidrio (GF/C, Brandel) mediante un recolector de células (MB48, Brandel). La incorporación de [3H]-hipoxantina se midió en un contador de centelleo líquido. El crecimiento del parásito se determinó comparando las desintegraciones por minuto (DPM) de los pocillos de control con los de prueba. Las curvas y los valores de IC50 se generaron mediante análisis de regresión no lineal (log (inhibidor) frente a respuesta) en el software GraphPad Prism 9 (Datos extendidos, figura 5).
Los cultivos de P. falciparum se sincronizaron con la etapa del anillo mediante incubación en sorbitol al 5% 48 h antes e inmediatamente antes del inicio del pulso del anillo joven. Se pulsaron H-ART, H-ARS, CQ, PY y MQ a concentraciones de 0 a 500 nM en cultivos sincronizados en etapa de anillo joven durante 3 o 6 h, se lavaron tres veces en medios de cultivo sin hipoxantina y luego se regresaron al cultivo completo. medios y se incubaron a 37 ° C con 0,5 μCi de [3H] -hipoxantina añadidos a cada pocillo. El pulso del anillo antiguo se inició 5 h después del pulso del anillo joven, el pulso del trofozoíto joven se inició 24 h después del pulso del anillo joven y el pulso del trofozoíto antiguo se inició 29 h después del pulso del anillo joven. El método completo se representa gráficamente en la Fig. 5a. Los pocillos de control de crecimiento negativo contenían CQ 10 µM. Los pocillos de control de crecimiento positivo contenían metabolitos o medios de cultivo libres de fármacos. El crecimiento del parásito se determinó comparando los DPM de los pocillos de control con los de prueba.
Las longitudes y anchos promedio de los cristales utilizados para probar los efectos de los fármacos y metabolitos en la cristalización en masa (Fig. 1) se determinaron a partir de mediciones de más de 30 cristales.
Evaluamos la velocidad del paso v monitoreando los desplazamientos de 8 a 13 pasos individuales. Se tomaron aproximadamente entre 25 y 35 mediciones para cada paso individual, para un total de ca. 300 medidas. Las velocidades promedio de los pasos se evaluaron mediante análisis de imágenes secuenciales a lo largo del tiempo.
Para determinar la tasa de nucleación bidimensional de nuevas capas, J2D, se monitorizó la aparición de nuevas islas en la superficie entre imágenes sucesivas y se contó el número de islas que crecieron. Este número se amplió con el área de escaneo y el intervalo de tiempo entre imágenes para producir J2D a partir de un promedio de 15 a 25 mediciones.
Se realizaron experimentos in vitro con P. falciparum para probar la reversibilidad de la inhibición (Fig. 5) en duplicados biológicos en diferentes fechas con pocillos técnicos por triplicado con diluciones del fármaco anotadas. Se utilizó el paquete de software Prism para generar dosis-respuesta versus inhibición con ajuste no lineal.
Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.
Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable. No se utilizó ningún código informático personalizado. Los datos de origen de las cifras se pueden encontrar en Datos complementarios.
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Este trabajo fue apoyado por NIH (Premio no. R01 AI150763), NSF (Premio no. DMR 2128121) y The Welch Foundation (Subvenciones No. E-2170 y E-1794). DJS agradece el apoyo del Johns Hopkins Malaria Research Institute y la Bloomberg Family Foundation.
Estos autores contribuyeron igualmente: Wenchuan Ma, Victoria A. Balta.
William A. Brookshire Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, Universidad de Houston, Houston, TX, 77204, EE. UU.
Wenchuan Ma, Weichun Pan, Jeffrey D. Rimer y Peter G. Vekilov
W. Harry Feinstone Departamento de Microbiología e Inmunología Molecular, Instituto de Investigación de la Malaria, Escuela de Salud Pública Bloomberg de Johns Hopkins, Baltimore, MD, 21205, EE. UU.
Victoria A. Balta y David J. Sullivan
Departamento de Química Aplicada, Universidad Zhejiang Gongshang, Hangzhou, Zhejiang, 314423, China
Pan Weichun
Departamento de Química, Universidad de Houston, Houston, TX, 77204, EE. UU.
Jeffrey D. Rimer y Peter G. Vekilov
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WM y VAB contribuyeron por igual. DJS y PGV concibieron este proyecto. Experimentos diseñados por PGV, DJS y JDR. WM llevó a cabo todos los experimentos de AFM y cristalización en masa. WP llevó a cabo una caracterización de la dispersión de la luz. VAB llevó a cabo todas las pruebas de parásitos de la malaria. WM, VAB, JDR, DJS y PGV escribieron el texto.
Correspondencia a Jeffrey D. Rimer, David J. Sullivan o Peter G. Vekilov.
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Communications Biology agradece a Angel Romero, Diogo Moreira y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal: Gene Chong. Un archivo de revisión por pares está disponible.
Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.
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Reimpresiones y permisos
Ma, W., Balta, VA, Pan, W. et al. Mecanismos no clásicos para suprimir irreversiblemente el crecimiento de cristales de β-hematina. Común Biol 6, 783 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05046-z
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Recibido: 05 de octubre de 2022
Aceptado: 14 de junio de 2023
Publicado: 27 de julio de 2023
DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05046-z
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